Roche/454

By 30 March 2018Uncategorized

Il sequenziamento 454 fu il primo metodo di sequenziamento di nuova generazione ad uscire sul mercato (2007). Con questo metodo il sequenziamento si può realizzare a partire da diversi tipi di acido nucleico: DNA genomico, DNA prodotto con una PCR, cDNA o BAC.I campioni che devono essere sequenziati vengono dapprima ridotti,tramite nebulizzazione, in frammenti più piccoli, di 300-800 bp.

Successivamente i frammenti sono trasferiti a nano-sfere, immobilizzate su un vetrino. Ad ogni particelle va a legarsi solo un frammento di DNA e l’unione non è covalente. Il sequenziamento avviene parallelamente alla formazione della catena complementare, ad opera della DNA polimerasi. Ogni frammento è legato a delle sequenze terminali complementari ai primers, necessari nella fase successiva di amplificazione.

L’innovazione del sistema 454-Roche sta nel fatto che con questa tecnica non vengono più utilizzati nucleotidi fluorescenti ma sfrutta il pirofosfato inorganico (PPi), prodotto di scarto della DNA polimerasi. Il pirofosfato inorganico è il substrato dell’enzima sulfurilasi che produce ATP a partire da PPi e AMP. A sua volta l’ATP viene prelevato dalla lucefirasi che lo utilizza per ossidare la luciferina. Grazie a questa ultima reazione si produce un segnale luminoso. I nucleotidi vengono aggiunti uno per volta proprio perché la fluorescenza è uguale per ciascuno di essi.

Il segnale è detectato tramite un fotodetector ed è possibile leggere la sequenza tramite un grafico. Esistono altre tecnologie di neosequenziamento come per esempio ABI/Solid e Illumina. Ion Torrent e il metodo di Oxford Nanopore appartengono ai sequenziatori di terza generazione. Con il passare degli anni, grazie a continue innovazioni in questo ambito, vengono continuamente scoperti aspetti nuovi del nostro genoma e non solo.