Curare l’anemia mediterranea modificando il DNA: l’editing genetico di CRISPR/Cas9.

La talassemia, meglio conosciuta come anemia mediterranea, potrebbe presto diventare la prima patologia umana, in Europa, ad essere curata usando la tecnologia di editing genetico CRISPR/Cas9.

CRISPR Therapeutics e Vertex Pharmaceuticals hanno presentato nel 2017 l’applicazione per uno studio di fase I/II, in Europa, per testare la terapia sul gene umano responsabile della beta-talassemia per la prima volta. Il trial clinico, approvato lo scorso Aprile, dovrebbe iniziare entro la fine del 2018.
A partire dall’avvento della tecnica di editing genetico CRISPR/Cas9, nel 2012, sono stati approvati decine di trial clinici, la maggior parte dei quali condotti in Cina, soprattutto in campo oncologico e, ultimamente, anche negli U.S.A.

Attualmente, ci sono 13 trial clinici registrati, in lista per l’impiego di cellule modificate con CRISPR/Cas9. Dieci si trovano in Cina e riguardano il trattamento di cancro e HIV mentre negli U.S.A., i ricercatori dell’Università della Pennsylvania stanno conducendo degli studi per poter utilizzare CRISPR/Cas9 per trattare melanoma, sarcoma, e mieloma multiplo.

Beta-talassemia. Al mondo nascono ogni giorno circa 60.000 bambini affetti da beta-talassemia, una rara patologia del sangue che comporta bassi livelli di ossigeno nel corpo e una grave forma di anemia.
Nella beta-talassemia l’organismo non produce abbastanza emoglobina nei globuli rossi.

La proteina dell’emoglobina (HbA) è costituita da quattro catene proteiche più piccole (sub-unità). Negli adulti ogni molecola di emoglobina contiene due subunità dette di tipo alfa e due subunità dette di tipo beta. La beta-talassemia, come si evince dal suo nome, deriva dalla sintesi difettosa delle catene beta dell’emoglobina. A causa della produzione difettosa di queste, le catene alfa si uniscono fra loro e formano degli aggregati che danneggiano la membrana del globulo rosso. Ne consegue che i globuli rossi vengono distrutti e non vi è abbastanza emoglobina circolante.

Sappiamo che l’emoglobina è la proteina di trasporto dell’ossigeno, quindi, se non ce ne è a sufficienza, i globuli rossi non riescono a trasportare abbastanza ossigeno a tutte le cellule ed hanno un’emivita ridotta.
Per questa ragione, i pazienti affetti da beta-talassemia sviluppano una condizione detta anemia, che comporta affaticamento muscolare, pallore, irritabilità, respiro affaticato, dolore toracico, difficoltà di concentrazione, vertigini e capogiri.

Il sistema cardiovascolare, il sistema nervoso centrale e l’apparato muscolare risentono infatti per primi dell’anemia. Il livello di severità della patologia dipende dalla quantità di emoglobina formata in totale.
Nei casi più gravi, la drastica diminuzione dei livelli di ossigeno al di sotto dei valori soglia, porta l’individuo a sviluppare forme di anemia talmente severe da richiedere regolari trasfusioni di sangue. In questa forma, la patologia è altamente invalidante e comporta un peggioramento della qualità della vita del paziete.

Il trial clinico richiesto da CRISPR Therapeutics si propone di sperimentare l’utilizzo dell’editing di CRISPR per inattivare il gene che causa la patologia, e al tempo stesso aiutare i globuli rossi a produrre una forma di emoglobina tipicamente presente nei neonati, che non è interessata dalla mutazione.

Come funziona CRISPR/Cas9. Si tratta di una tecnologia di gene editing (“modifica del DNA”) che può selettivamente eliminare, modificare o correggere una malattia dovuta a mutazioni, delezioni, inattivazioni o altre anomalie che interessano uno specifico tratto di DNA.
La tecnica è particolarmente conosciuta per essere rapida e relativamente semplice da applicare.
“CRISPR”, acronimo di Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (in altre parole, sequenze geniche che si ripetono) e il gene Cas ad esso associato, sono essenziali nell’immunità adattativa di alcuni batteri, grazie ai quali i microrganismi sono in grado di rispondere all’invasione di materiale genetico estraneo, con cui vengono a contatto dopo l’attacco di batteriofagi (virus che infettano i batteri e si replicano al loro interno) e di eliminarlo.

Queste brevi ripetizioni di sequenze di DNA vennero inizialmente scoperte nel 1980 nel batterio E. Coli, ma la loro funzione non fu confermata fino al 2007 da Barrangou e il suo team di ricerca, che dimostrò come il batterio S. Thermophilus possa diventare resistente contro un batteriofago integrando un frammento del genoma dello stesso virus che l’ha infettato, all’interno di un locus del sistema CRISPR.
Sono stati identificati 3 tipi di sistemi CRISPR. Il tipo II è un meccanismo unico, se comparato con gli altri sistemi CRISPR, in quanto è l’unico a coinvolgere la proteina Cas9, la cui funzione è quella di silenziare alcuni geni.
In questo caso, il DNA “invasore” (di un fago o un plasmide) viene tagliato in piccoli frammenti e incorporato in un locus di CRISPR, tra una serie di brevi ripetizioni (intorno alle 20 paia di basi).

Il punto preciso in cui la Cas9 taglia il DNA da modificare è specificato da una RNA guida, composto da crRNA (CRISPR-RNA) e tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA). L’RNA guida può dirigere le “forbici molecolari” per tagliare il DNA sull’esatto sito dove è presente la sequenza complementare.
Dopo che CRISPR ha operato il taglio nel DNA, questo verrà riparato tramite DNA endogeno, in modo da operare una correzione/sostituzione nella sequenza di DNA patogeno.
La semplicità del sistema CRISPR/Cas9, di soli 3 componenti (Cas9, crRNA e trRNA) rende questo sistema particolarmente adatto all’editing genetico. CRISPR/Cas9 può “selezionare” sequenze specifiche di un gene e inserire o rimuovere sequenze di DNA.

CRISPR/Cas9. Image from labiotech.eu

Il trial. Data la sua accuratezza, i ricercatori hanno sviluppato metodi per utilizzarlo per modificare sequenze anomale che causano disordini genetici come la stessa beta-talassemia o anche l’anemia falciforme.

Si tratta di una terapia ex vivo che prevede il prelievo, dal paziente, di cellule del midollo osseo, in grado di generare globuli rossi.
Successivamente verrà utilizzato CRISPR/Cas9 per inattivare il gene della beta-globina (che causa la malformazione delle catene beta nell’emoglobina, dando origine alla patologia), permettendo alle cellule del midollo osseo di produrre un’emoglobina modificata, in questo caso l’emoglobina fetale, non interessata da questa specifica mutazione.
Le cellule trasformate con CRISPR/Cas9 verranno poi trasfuse nuovamente nel paziente, dove l’emoglobina fetale si occuperà del trasporto di ossigeno per sopperire ai geni difettosi della beta-globina.

In altre parole, si tratta di un trapianto autologo di cellule del midollo osseo ingegnerizzate con CRISPR/Cas9.
I limiti più evidenti di questo trattamento sono i lunghi ricoveri ospedalieri previsti nei casi di trapianto di midollo e i costi piuttosto elevati.

Images via CRISPR Therapeutics; World Health Organization.

Il futuro di CRISPR/Cas9. Da quando questa tecnica è stata introdotta nel 2012, il sistema CRISPR/Cas9 è stato ampiamente adottato, permettendo di identificare con successo importanti geni in varie linee cellulari e organismi, inclusi gli umani, i batteri, lieviti, diverse piante e alcuni mammiferi.
Diversi gruppi di ricerca hanno applicato questo metodo per introdurre una singola mutazione, tramite delezione o inserzione, in un particolare gene target, utilizzando un singolo RNA guida.
Invece, utilizzando la nucleasi Cas9 a due RNA guida, è possibile indurre ampie delezioni o ri-arrangiamenti del genoma, come l’inversione o la traslocazione.
Di tutti i sistemi per il gene editing attualmente disponibili per l’ingegneria di precisione genomica, il sistema CRISPR/Cas9 è fino ad ora il più semplice, efficiente e versatile da utilizzare.

sources:
CRISPR/Cas9 & Targeted Genome Editing: New Era in Molecular Biology
CRISPR Therapeutics and Vertex Pharmaceuticals are taking action to start a first clinical trial with CRISPR/Cas9 in Europe in 2018.

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